根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

免疫组化实验操作
1. 60℃烤片2小时
2. 脱蜡。二甲苯脱蜡15分钟，三次
3. 水化。依次经过无水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分钟，蒸馏水（或自来水）5分钟
4. PBS洗5分钟，三次
5. 抗原修复。枸橼酸缓冲液（约92-95℃）煮沸（沸水浴）修复15分钟，自然凉至室温。PBS洗5分钟，三次
6. 3%双氧水封闭20分钟，PBS洗5分钟，三次
7. 正常山羊血清封闭，37℃20分钟
8. 一抗孵育，4℃过夜.
9. 复温20分钟，PBS洗5分钟，三次
10. 二抗孵育，37℃20分钟（二抗为生物素标记的羊抗兔IgG），PBS洗5分钟，三次
11. 三抗孵育，37℃20分钟（三抗为辣根酶标记的链酶亲和素），PBS洗5分钟，三次
12. DAB显色，镜下观察结果，适时终止
13. 苏木素复染5分钟，自来水冲洗片刻，75%的盐酸酒精溶液分化30秒，自来水冲洗5分钟蓝化
14. 脱水。依次经过70%、80%、90%、95%、无水乙醇，各5分钟，二甲苯15分钟，三次
15. 封片，中性树胶封片

免疫组化样本准备

组织切片或组织蜡块

ELISA原理　

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 　　

ELISA实验操作
取出试剂盒，于室温（20-25℃）放置15-30分钟。实验过程应在室温（20-25℃）内进行。
取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100 μl的标准品溶液于空白微孔中。
空白微孔中加入100 μl的样品，空白对照加入100μl的蒸馏水。
在各孔中加入50μl的酶标记溶液（不含空白对照孔）。
将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应 1小时（在孵育箱中保持稳定的温度与湿度）。
充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）。
酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。
各孔加入显色剂A 50 μl。
各孔加入显色剂B 50 μl。
20-25℃下避光反应10分钟。
各孔加入50μl终止液，终止反应。

ELISA样本准备
　　在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请造模取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。代测放免标本的客户取材前须向我司销售人员索要说明书，具体操作注意事项请与我司技术人员沟通。

◇液体类标本：
　　包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。
*血清：
　　室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
*血浆：
　　应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
*尿液：
　　用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
*细胞培养上清：
　　检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
*组织标本：
　　切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

Western blot 原理
　　Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

Western blot 操作步骤
组织裂解
(1)称取100mg脑组织，剪碎后放入研钵中，然后加入液氮研碎组织，直至成粉末状；
(2)加入1ml裂解液（裂解液中含有临时加入的10μl蛋白酶抑制剂混合物），研磨，直至成为液体；
(3)转至EP管，冰上静置10min；
(4)4℃，12, 000r.p.m.，离心10min，取上清（胞浆蛋白）；
(5)－80℃，分装冻存。

制备SDS-PAGE凝胶
(1)将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm处）。
(2)配制10%分离胶8ml（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
(3)立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固。
(4)配制5%浓缩胶4ml（见下表）。

	10%分离胶		5%浓缩胶
体积	8ml	4ml	4ml	2ml
ddH2O	3.2ml	1.6ml	2.72ml	1.36ml
30%丙烯酰胺	2.67ml	1.33ml	0.66ml	0.33ml
1.5MTris-cl (PH 8.8)	2.0ml	1.0ml
1.0MTris-cl (PH 6.8)			0.5ml	0.25ml
10%SDS	0.08ml	0.04ml	0.04ml	0.02ml
10%AP	0.08ml	0.04ml	0.04ml	0.02ml
TEMED	3.2μl	1.6μl	4μl	2μl

 


 








(5)倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40分钟。
(6)轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。

样品变性及电泳
(1)由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。
(2)根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液,轻轻混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用。
(3)将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。

3.4 凝胶转膜及其检测
　　凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。用于Western印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物。本实验采用湿转的转膜方式。
(1) PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用；
(2)剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。
(3)取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。
(4)将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。
(5)正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，65v转膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中进行）。
(6)封闭：小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h。
(7)一抗反应：将一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。
(8)洗膜：将反应膜放入平皿中，用1×TBST洗涤三次，（室温下缓慢摇动洗涤）每次10分钟，洗净未结合的一抗。
(9)二抗反应：将二抗用1×TBST稀释3000倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用60分钟。
(10)洗膜：用1×TBST洗膜，方法同(8)，洗去游离二抗。
(11)曝光及洗片：
①按1：1（v/v）混合ECL试剂盒中两种液体。
②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住PVDF膜。

Western blot 样本准备

　　应是新鲜的组织细胞样品，需低温保存提供到我公司
　　实验所用试剂；除第一抗体外，所有试剂免费，用户无须另行购买