免疫组化操作步骤

　　第一节 免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）
　　第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）
　　（一）、仪器设备
　　1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
　　2. 水浴锅
　　（二）、试 剂
　　1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）
　　2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）
　　3. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
　　4. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
　　5．TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4适合光学纤维标本
　　（三）、操作流程
　　1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
　　a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
　　b 无水乙醇中浸泡五分钟
　　c 95%乙醇中浸泡五分钟
　　d 75%乙醇中浸泡五分钟
　　2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

　　抗 原 修 复（免疫组化石蜡切片）
　　用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复
　　福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。
　　抗原修复的几种常用方法（供参考）
　　1. 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。
适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：
　　2. 沸热修复： 电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
　　3. 高压热修复：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复）
　　4. 酶消化方法：
　　常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等

               石蜡切片免疫组化染色步骤

　　1.三步法（以SP试剂盒为例）
●石蜡切片脱蜡至水。
●蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。
●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
●5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●显色剂显色（DAB或AEC）。
●自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。
●如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。
　　2.SABC法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2次各5分钟
（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
（12） PBS洗4次各5分钟
（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。

　　冰冻切片的免疫组化染色步骤
●速冻组织
●冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
●室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

             第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）

　　1、 抗原热修复温度和时间的关系
我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下：
第一步基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物
第二步基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥
　　上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：
　　抗原热修复的有效性=加热温度（T） × 加热时间（t）
　　也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表1中也可以清楚地看出。
时间和温度对染色的影响
 时间（分钟）
100℃ 80℃ 60℃
5×2    + + +   ―  ―
5×6   + + + +   + + +  ―
5×10   ―  + + + +  +
10小时   ―  ―  + +
　　 如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。
　　2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
　　大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也相应增高（如图1所示），这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。
　　固定时间和变性的关系
　　 这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。
　　 3、 不同PH值抗原修复液对染色结果的影响
　　 抗原热修复中所使用的修复液PH值也会对染色结果产生相当大的影响。PH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。
A―稳定型，PH值对染色结果影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B―V型，高PH值和低PH值染色较好，而PH值4-5染色结果较差，如ER、Ki-67等。
C―上升型，随着PH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。
D―下降型，随着PH值的增加染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。
　　一个有趣的现象值得注意，即在高PH值都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值得修复液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用PH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高PH值得修复液来代替目前广为使用的PH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用PH9.0得修复液效果都要优于PH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高PH值的抗原修复液是今后的必然趋势。
　　4、抗原热修复的手段
　　微波炉修复和高压锅修复的比较
 　　　　温度   压力      v时间    　　受热
微波炉   100℃   1P      15~20分钟   不均匀
高压锅   120℃   1.2P    喷气2分钟   均匀
　　目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种，从表中可以看出，由于高压锅修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点，已经越来越受到人们的青睐。

  免疫组化问题解答

1、染色过强
原因 解决方法
a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度
c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因 解决方法
a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟
b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因 解决方法
a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟
b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释 （应防止切片干燥）
d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜
e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟
4、染色阴性
原因 解决方法
a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照
b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果
c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误

速冻组织
●将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
● 冰冻切片4～8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
●室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。
●PBS洗，5分钟×3。
● 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
●PBS洗，5分钟×3。
●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

影响抗原热修复的关键因素

　　目前免疫组织化学染色技术已经广泛应用到各级医院临床病理诊断中，但是由于实验条件的差别和传统观念的影响，使得免疫组化染色结果差别很大，从而影响到病理诊断这个“金标准”的含金量，给医院和病人带来一些不必要的损失。所以，提高免疫组织化学染色技术水平的需要变得越来越迫切。众所周知，免疫组织化学染色中最关键的步骤莫过于抗原的修复了，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，可以这样说，抗原热修复是免疫组化的关键技术，会直接影响到最终的染色结果。
1、抗原热修复温度和时间的关系
　　我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如示：上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：
抗原热修复的有效性=加热温度（T）×加热时间（t）
　　也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就会越长；反过来当修复温度增高时则修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表一中也可以清楚地看出。如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露出的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。
2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
　　大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也会相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。这就提醒我们在做回顾性研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。
3、不同pH值抗原修复液对染色结果的影响
　　抗原热修复中所使用的修复液pH值也会对染色结果产生相当大的影响。pH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。
A — 稳定型，pH值对染色结果的影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B — V型，高pH值和低pH值染色较好，而pH值4-6染色结果较差，如ER、Ki-67等。
C — 上升型，随着pH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。
D — 下降型，随着pH值的增加，染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。　　　　　一个有趣的现象值得注意，即在高pH值（约pH8.0~9.0），A、B、C三者都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高pH值的修复液，如1mM EDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用pH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高pH值的修复液来代替目前广为使用的pH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用pH9.0的修复液效果都要优于pH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高pH值的抗原修复液是今后的必然趋势。
4、抗原热修复的手段
　　目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种，从表二中可以看出，由于高压修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点，已经越来越受到人们的青睐。
5、抗原热修复具体操作过程
　　可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以1mM的EDTA抗原修复液（pH8.0或pH9.0）效果最好。
　　5.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，蒸馏水冲洗2分钟×3。将切片放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在96℃~98℃之间并持续15~20分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却20~30分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，避免蛋白恢复至原有的空间构型）。PBS洗，3%H2O2处理10分钟，下接免疫组化染色步骤。
　　5.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将适量的抗原修复液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1.5~2.5分钟，然后将压力锅端离热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，3%H2O2处理10分钟，下接免疫组化染色步骤。
　　5.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。