上海蓝基生物科技有限公司是专业化的抗体试剂开发、生产公司，有着一整套完整、规范的蛋白检测及鉴定技术。为了适应广大生物医学领域科研人员及学者对Western Blotting 实验日益增长的需求，为从事生命科学研究的学者提供快捷方便的服务，本公司实验室将提供Western Blotting的对外技术服务。
1. Western Blotting ：每张膜可做1-8个样品 ；收费标准：1600.00元/每膜
2. 检测方法：NBT或ECL化学发光检测法；预计完成时间：2周工作日
3. 对预做实验提供的样品要求：应是新鲜的组织细胞样品，需低温保存提供到我公司
4. 实验所用试剂；除第一抗体外，所有试剂免费，用户无须另行购买
5. 因用户所提供的样品或试剂所导致的实验问题，由用户负责
6. 最后提供检测结果： 根据客户要求提供曝光X胶片或NBT染色的NC膜或扫描图片

细胞和组织的蛋白提取
培养细胞
取出裂解液，待融化后，颠倒混匀数次，适量分装冻存。在使用前取出，按比例加入PMSF（使其最终浓度为1mM），混匀，立即使用。
（1）贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍（如血清中的蛋白没有干扰，也可以不洗）。按6孔板每孔加入100-200微升的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞数秒后细胞就会被裂解。
（2）悬浮细胞，收集培养细胞，离心去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2-3遍（如血清中的蛋白没有干扰，也可以不洗），用手指把细胞用力弹散，按6孔板每孔细胞加入100-200微升的比例加入裂解液。如果细胞数量较大，应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加裂解液。用手指轻弹管底以促进裂解液和细胞充分接触，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。
裂解物经10000-12000离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的western实验。
裂解液用量说明：通常6孔板细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。
2．组织样品
取EP管，分别称重标记，把组织剪切成小块装入EP管中，称重。按每20毫克组织加200-400微升的比例加入裂解液（如裂解不完全，可以适当增加裂解液的用量；如需要的蛋白样品浓度较高，可以适当减少裂解液的用量）。用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。12000转离心10分钟，取上清，即可进行后学的western操作。
BCA测蛋白方法
蛋白质定量是蛋白质研究的基础工作之一,BCA蛋白质检测试剂(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法;是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。该方法以快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍受专业人士的青睐。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。该产品不受此影响，因此与之配合使用，可免除您实验中的许多烦恼。

基本原理
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

主要特点
1.准确灵敏,线性范围广: BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；
2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。

包装及保存
BCA试剂 A 70ml室温保存
BCA试剂 B1.4ml室温保存
蛋白标准 0.5ml
 
注意事项
1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解,如发现细菌污染则应丢弃
2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔,每次均应做标准曲线。
4.当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。
5.需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减 少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。

使用说明
1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。
3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。
4.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
5.冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下二者在使用中的区别？
选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
2.没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
3.做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。
4.western blot使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。
5.为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请指教 .做WESTERN必须要内参吗？
一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。
6.western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？
作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
7.半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？
可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
8.Western Blot哪种染色好？
（1）阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
9.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？
可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
10.DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？
DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。
11.酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？
免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。
免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。

western实验步骤

组织裂解
(1)称取100mg脑组织，剪碎后放入研钵中，然后加入液氮研碎组织，直至成粉末状；
(2)加入1ml裂解液（裂解液中含有临时加入的10μl蛋白酶抑制剂混合物），研磨，直至成为液体；
(3)转至EP管，冰上静置10min；
(4)4℃，12, 000r.p.m.，离心10min，取上清（胞浆蛋白）；
(5)－80℃，分装冻存。

制备SDS-PAGE凝胶
(1)将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm处）。
(2)配制10%分离胶8ml（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
(3)立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固。
(4)配制5%浓缩胶4ml（见下表）。