一、surface marker染色

　　1、收获细胞，0.5-1x10e6/tube，用FACS Buffer 2ml洗涤一次，倾倒后滤纸吸干管口液体。

　　2、加入预先配置好的你需要染的surface marker的抗体混合液（即CD3，CD4，CD8抗体mixture），充分混匀，室温下孵育20分钟。

　　3、FACS Buffer 2 ml洗涤一次倾倒后滤纸吸干管口液体。

二、Intracellular Staining的步骤

　　1、加入Fix/permeabilizatioin Buffer（不同公司有各自的试剂，ebioscience或者BD，看你的抗体是那个公司的，但是操作流程大致相同）

　　2、加入Fix/Perm Buffer 250ul 后，混匀，4度孵育30分钟（公司可能推荐1ml，我一直加250ul，绝对可行）或者室温15～20分钟

　　3、用公司配套的Perm Wash Buffer 1x的2ml洗涤1-2次，本人一直洗一次节约试剂，也没有问题

　　4、如果有Isotype染色的，需要加Normal Rat Serum 4ul 进行blocking，混匀，室温下孵育15分钟

　　5、如果不做Isotype，第4步可以省略

　　6、不必洗涤，直接加入细胞因子抗体，室温下孵育30-60分钟，我建议是60分钟，比30分钟好，你也可以自己摸条件

　　7、最后再用1xPerm Wash Buffer 2ml洗一次，倾倒后，加入适量FACS Buffer就可以过流式了。