一、工作原理：

　　将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

　  流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

　　这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

　　检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

　　细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

二、客户提供：
1）标本:组织、细胞、全血（抗凝）
2）抗体（荧光素标记）
PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广
biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
3）其他试剂（如Fluo-3）
4）染色试剂盒

三、样本及制备：
1.样本及来源：
1) 单个细胞：1~2×106 个细胞左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
2) 外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
2.送检样本量：
1)单个细胞：1~2×106 个细胞左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
2)外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
3. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
3)用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
4)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
4. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：
1)收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。
2)用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；
3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。
4)加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。
5)加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。
6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
5.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：
1)待测样本制成单细胞悬液，然后2000转/分离心5分钟，弃上清。
2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
3)调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
4)PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。