污染是细胞培养技术中面临的主要问题。某些污染的发生往往难以察觉检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的害最大。随着污染微生物的不断增殖，交叉污染可能性也不断增加。此外，微生物代谢消耗大量需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。因此，识细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染保证实验体系的稳定性和可靠性。
　　1 细胞培养基本技术　
　　为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。细胞冻存库应该分主细胞库(Master cell bank，MC和工作细胞库(Working cell bank，WC，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定。
　　为了保证培养细胞系的完整性，必须进行详细的实验记录，应包括以下内容:细胞系的种类及来源、有无污染(如细菌，病毒，支原体)、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。详细的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。随着培养时间的延长生长速，度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势这种选择性，趋势会影响整个细胞群的生物特性。应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。建立细胞冻存库就能避免这种影响通过复苏相同代数的细胞，人们就能在较为均一的条件下重复实验。
　　细胞培养工作需要清洁，保持良好的环境及规范的操作程序。超净工作台是细胞培养中普遍使用的无菌操作装置，它需要合理的布置及经常性的维护。超净工作台的工作原理是驱动经高效滤菌净化后的空气，通过工作台面形成气流屏障，从而阻止外界污染物的侵入并使操作过程中产生的飞沫限制在超净工作台中。因为操作过程中可能产生有毒的物质，所以采用垂直气流比水平气流安全。
　　当进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。
　　2　细胞培养的污染　
　　细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。细胞培养污染可分为以下三类：物理性、化学性及生物性。为了使细胞培养的结果更可靠，应该固定所有培养条件，并保证其重复性。
　　2.1　物理性污染的来源、危害及预防　物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。
　　2.2　化学性污染的来源、危害及预防
　　培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。
　　2.2.1　水　水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。
在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。
　　2.2.2　血清　动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。
　　2.2.3　培养液、培养附加成分、试剂　培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。
　　2.2.4　培养器皿及容器　细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。
　　2.3　生物性污染的来源、危害及预防　外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物(通常指支原体)和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染。只要在一个开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作方法、培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。细菌、真菌或其它微生物污染的检测可以用不同培养基进行检查。支原体污染的检测需要特殊的方法。病毒污染的检测可以使用许多体内或体外实验，包括大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血试验、红细胞吸附试验等。
　　细菌和真菌的污染较易发现并及时清除，而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识。为了防止支原体及其它微生物污染的发生和传播，必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度。支原体归属
　　于柔膜体纲(Mollicutes)的支原体目，它们都具有以下共性:无细胞壁、无细胞壁主要成分———粘肽的表达。支原体与其它细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其它甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很3大。支原体直径仅有013～018μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。需要指出的是，只要有一个具有增殖能力的支原体就能引起培养体系的污染。一旦细胞被污染，支原体的滴度随着时间的延长而逐渐升高，最高可至每毫升10克隆。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验结果。
　　2.3.1　来源　培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。细胞被支原体污染后，支原体可以与宿主细胞形成一个共生体系，使污染不断扩大。一旦发生支原体污染，支原体和其它微生物会随着飞沫而不断传播。操作过程中移液，倾倒液体时都会产生具有潜在感染能力的飞沫，并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。此外，操作失误引起的交叉污染也是支原体污染的一个常见途径。人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，如M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原体等。无菌操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。人体外周血、骨髓、淋巴组织原代培养中有可能发生发酵支原体的原发污染(primarycontamination)，这也证明支原体在分化细胞中较未分化细胞更易生长。随着培养技术的不断发展，人们已能培养来自不同物种如动物、植物、昆虫的各种细胞，同时也扩大了支原体及其它微生物的宿主范围。此外，某些支原体，如菜氏无胆甾原体科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、M.hyorhinis、口腔支原体、唾液支原体能寄生不同的宿主，并能在培养体系中稳定增殖数年。牛血清中能分离到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源。由于无血清培养基中许多附加成分及试剂是从血清或其它生物制品中制备的，因此无血清培养体系并不能排除支原体污染的危险。尽管随着培养技术的进步，血清发生污染的可能性进一步降低，但只要有一个活的支原体能通过滤菌器，整个培养体系就会被污染。
　　2.3.2　危害　支原体通过产生代谢产物及消耗各种养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而改变细胞的代谢状态。支原体可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体可以利用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列改变，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及补偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度，导致细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随后，细胞的生长特性发生改变，使某些酶和细胞因子的产生增加，并表现出一些特殊的细胞功能，而其它一些细胞正常的功能则被抑制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜
抗原成分。随着细胞膜成分的改变，细胞的形态及抗原性发生改变。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验结果导致研究误入歧途。此外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到抑制并丧失产生单抗的能力。
　　2.3.3　预防及控制　污染发生后首先应确定污染物的种类及污染的程度。为了能正确检测细菌或支原体的污染，应先撤去培养液中的抗生素。常规细胞传代培养中应用抗生素会导致:①掩盖了不很严重的污染;②导致了耐药菌的产生。每一种抗生素的抗菌谱都是有限的，而且许多抗生素仅是抑制细菌生长，而非杀菌剂。因为支原体无细胞壁，所以青霉素，头孢菌素等干扰细胞壁合成的抗生素对于支原体无效。菌检及支原体检测只有在撤去抗生素后才能进行。实验中若发生污染或其它问题应有详细的记录，并由经验丰富的专家分析，找出哪个环节出了问题，包括培养液的配置、实验室环境的保持和无菌操作过程等，从而不断完善操作规程，避免类似问题的现。此外，管理者还应制定细胞培养的各项规章制度，教育每一个实验人员遵守。实验室负责人应根据情况，制定修改各项规范的操作程序及人员培训计划。一般来说，随着实验室规模的扩大，细胞发生变异和污染的可能性增加了。因此，大型实验室应严格制定各项操作程序及规章制度。细胞培养中无菌操作需要清洁的工作环境、实验的合理安排、实验者熟练的操作技巧及强烈的责任感。只有通过不断地学习、训练，才能熟练掌握无菌操作技术。为了尽可能减少污染的发生，以常规检查的方式来监督是必要的。细胞培养中发生污染是不可避免的，我们的目的是尽可能减少污染的发生及危害。
　　根据美国实验室的调查报告显示，至少10%的细胞系存在支原体的污染。一旦发生污染，如果细胞有详细的记录，则污染引起的危害较小。我们可以根据细胞定期菌检记录拼弃最后一次细胞菌检阴，性后的实验结果。利用菌检阴性的细胞重新开始实验。如果仅偶尔进行菌检或采用非特异检测方法，尤其是支原体污染，那么确定污染的范围比较困难。因为所有的细胞系都有可能被交叉污染。一旦发生污染，所有未进行菌检的冻存细胞都必须进行菌检，以去除污染的细胞并明确污染发生的时间。
　　2.3.4　检测　由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，有必要对不同检测方法的灵敏度及局限性有所了解。
　　不同检测方法对送检标本的要求不同，如果标本不合格，将不可能获得正确的结果。血清、培养液或培养基附加成分在加工和储存过程中污染会在一6定程度上被稀释，影响检出率。间接检测法由于其敏感性较差，若不采用浓缩标本，则不适用于检测血清和培养液的污染。由于污染物的随机分布，因此仅进行一次检测通常会出现假阴性。如果标本中污染物浓度低于10个污染物/ml，随机抽取1ml标本进行检测可能有366%的假阴性率。增加1标本体积，浓缩标本有助于降低假阴性率。另一种假阴性的产生是由于污染物在试剂瓶，冻存瓶等容器中的分布不均所致。若20个样品中有一个被污染(5%的污染率)，检测所有20个样品，假阴率为。需要指出的是仅仅单次检测一个标本来3616%，判断有无生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分装液体前，就应当从原液中尽可能多取一点液体进行检测。如果不能做到这一点，则应该用标准方法选择多个标本进行检测。例如，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。
　　标本的处理与标本的选择同样重要。各种酶如胰酶、脂酶，强酸，强碱或其它化学物质会破坏支原体膜的脂质，使支原体丧失活力及膜的完整性。膜的完整性被破坏后，支原体内的蛋白酶及核酶释放，从而会干扰间接检测方法的结果。如果标本收集后不能当天检测，则应该尽快冻存标本以防止降解。
　　选择、处理检测标本的目的是尽可能发现潜在的污染。在细胞培养过程中就应考虑到支原体污染的检测。我们最好选用无抗生素培养，检测应尽可能离传代时间长一点，以便让任何潜在的污染物生长、繁殖。为防止支原体活力丧失，如果检测的是贴壁细胞，应采用刮除细胞的方法，因为胰酶或其它生化分离方法会降低支原体的活性。在选用合适的检测方法时，应考虑到支原体的滴度和活力这两个因素。直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测方法，大约需28天。从理论上讲，只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。理想的直接培养法应采用多功能的培养基，以降低假阴7性率。为增加对低滴度和低活力支原体检出率，应采用有氧和无氧两种培养条件及几种传代方式。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，而且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。检测支原体污染的间接法包括CR、ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化7分析法等。间接法能检测到10/L的滴度。通常情9况下，支原体污染后其滴度一般超过10/L，故尽管间接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样，表达不同特异性的抗原及酶，为生化及免疫检测8法带来技术上的困难。在选择PCR、DNA探针等方法前，应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原5体检测的金标准。美国、加拿大、日本和欧共体国家生物制药及诊断的监督机构推荐使用这种方法。其基本原理在于利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。
　　2.3.5　控制及排除　控制支原体污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高压蒸气灭菌法消毒。所有细胞培养设备都应消毒，应严格遵守上述的各项规章制度及监督制度，直至所有潜在的污染源都被消除。细胞一旦被支原体污染，要将它清除是非常困难的。由于一些不可复得的细胞被污染，人们不得不设法清除污染，挽救一些珍贵的细胞。事实上，经支原体污染的细胞，在污染经处理被清除后，细胞原有的许多生物学特性，如基因的表达，抗原性和代谢特点也随之发生了相应的改变。排除支原体污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠体内接种、巨噬细胞吞噬、胰酶消化等方法，但没有一种方法是普遍有效的。所以在采用每一种方法时必须对其效果以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。Del6Guidice和Gardella提出了一个有效的方法，其基本步骤包括首先分离、鉴定污染物及测定对抗生素的敏感性，然后使用至少两种敏感的抗生素进行处理。为增加排除污染的有效性，可以通过稀释以降低血清及其它促生长因子的浓度，从而降低细胞的密度。治疗后细胞应在无抗生素条件下培养若干代，以确定污染已被彻底清除。细胞培养过程中支原体污染不易察觉，细胞被支原体污染后清除非常困难，支原体污染的细胞在支原体被清除后，其细胞特性会发生很大改变，对研究结果造成严重影响因此，为了保证细胞培养体系免受污染的影响，关键是加强预防措施。