一.实验目的

　　用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。

二.实验原理

　　线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
　　制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次在分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
　　线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。

三.大鼠肝线粒体的分离

实验用品

(一)、材料
大鼠肝脏

(二)、试剂
　　1．生理盐水。
　　2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
　　3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—盐酸缓冲液(pH7．4)：
　　0．1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
　　0．1 mol/L盐酸 8．4ml
　　加重蒸水到 100ml
　　加蔗糖到0.25 mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖
　　4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—盐酸缓冲液(pH7．4)
　　5．固定液：甲醇—冰醋酸(9：1)
　　6．姬姆萨染液：Giemsa粉0．5g，甘油33ml，纯甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。用时吸出少量用1/15mol/L磷酸盐缓冲液作10～20倍稀释。
　　1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6．8)： 
　　1/15 mol/L KH2PO4 50ml
　　1/15 mol/L Na2HPO4 50ml

(三)、器材 
　　高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器。

实验方法

　　1．制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0～4℃的0．25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0．25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

　　2．差速离心。先将9ml 0．34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机进行差速离心（见图）。

　　3．分离物鉴定。
　　　(1) 细胞核；取细胞核沉淀一滴涂片，用甲醇—冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液(原液10～20倍稀释)染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。 

　　　(2) 线粒体；取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。

实验注意事项

　　如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。

作业与思考题

作 业
　　将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。

思 考 题 
　　1．分离介质0．25mol/L及0．34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用?
　　2．分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色，比较二者着色的差异。

四.玉米线粒体的分离

实验用品

(一)、材料
　　玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。

(二)、试剂 
　　1．分离介质；
　　0.25 mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris—盐酸缓冲液(pH7．4)，3 mmo/L EDTA，0．75mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
　　50mmol/L的Tris—Hcl缓冲液(pH7．4)配法：
　　50ml 0．1 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42ml 0．1 mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
　　2．保存液：0．3mol/L甘露醇(pH7．4)
　　3．20％次氯酸钠(NaClO)溶液。
　　4．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。

(三)、器材
　　温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷冻控温高速离心机。

实验方法

　　从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因—线粒体DNA等目的。
　　分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0．25 mol/L蔗糖也可以用 0．3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二价阳离子，Ca2＋除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。

　　1．玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培肓2～3d。待芽长到1～2cm长时剪下约15g，放0～4℃1h。
　　2．加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
　　3，用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。
　　4，取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
　　5．沉淀为线粒体，可存于0．3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0～4℃进行。

实验结果

　　线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。