1.概述
　　流式细胞光度计(flow cytometry)可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。

　　细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异染色，然后将悬液中的细胞以1个细胞／ms的速度(1 000万细胞/h)一个个地通过流式细胞仪，此时检测器便可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量，并根据要求将该成分含量不同的细胞分离出来。如果染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以继续培养。

2.工作原理
　　流式细胞光度计(简称FCM)是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ—射线能谱术
及电子计算机等新技术与显微荧光分光光度计密切结合的高度精密仪器。在电子计算机操作 程序控制下能灵敏而快速地对大量单细胞样品进行多信息分析与测定。目前，FCM技术已广泛地应用于生命大分子物质的定量、细胞周期分析、细胞表面抗原、受体、染色体、核浆比例、活细胞分类等细胞生物学各领域的研究工作中。

　　其主要工作原理是：经荧光染色的单细胞悬液被高压压入流动室内，在PBS或生理盐水等壳液(Sheath Fluid)的包裹和推动下形成单细胞状态，并以每分钟5000—10000个细胞的高速度从流动室内喷出。在与细胞束呈90°角的方向，受到来自氩离子激光器的激光束照射而激发荧光。通过各种物镜及滤光片将从不同角度收集的荧光投射到光电倍管并转换为各种强弱不等的电脉冲信号显示出来。这些信号输到电子计算机中贮存，经处理和分析便可得到多种信息参数。进行细胞分类时，根据需要对含细胞的水滴选择性充电，在带有高电压的偏转板作用下，带正电荷的水滴落入左方收集管内，带负电荷的水滴落入右方收集管内，不带电荷的水滴进入中间的收集管。分类主要根据细胞的荧光强度，即单细胞DNA含量。

3.FCM系统调试：
　　以FACS-Ⅲ型机为例，调试的原则是：得到较高的分辨率，即对某一特殊样品测得的变 化常数CV值，CV值越小越好。得到较高的灵敏度，即可测出最小荧光分子数。

　　调试仪器要有理想的标准品，其条件是：①稳定；②颗粒大小和荧光性要均匀；⑧标准 品本身的CV值要低于仪器的CV值；④易得，易制成悬液。目前常用的标准品有：④荧光 微球，⑥鸡红血球悬液，它易得，制备方法简单，易保存，且血红蛋白可自发荧光。

4.样品制备过程
　　着重介绍单细胞悬液的制备方法，这是生物学工作者最为关心的问题。悬液培养样品或 各种腹水细胞本身就是单细胞悬液，可直接使用。下面介绍单层培养样品及实体组织的制备方法。 

Ⅰ　酶法：应用最广泛的是胰蛋白酶。

　　(1)单层培养的样品：器材和试剂：玻璃滴管数只(灭菌)；5ml移液管5只(灭菌)；10ml移液管3只(灭菌)；离心管数只(灭菌)；灭菌超净台；恒温水浴箱；离心机、冰箱；PBS液(灭菌)；胰蛋白酶溶液。

　　步骤：①去掉培养基；②用5ml冷PBS滴轻轻冲洗细胞后去掉；⑧加2毫升胰蛋白酶液，37℃保温5分钟，轻轻摇动培养瓶或用滴管吹盯数次使细胞最大程度游离；④加8ml含血清的培养基以抑制酶活性，⑤把细胞悬液移到离心管内，250g离心5分钟；⑥弃上清，将细胞重新悬于10ml冷PBS中，搅匀；⑦250g离心5分钟，弃上清加5ml乙醇固定，保存于4℃备用。

　　(2)实体组织：器材和试剂：眼科剪、眼科镊各一把；50ml小烧杯数个；玻璃滴管数只；小块双层纱布；普通光学显微镜；恒温水浴箱；离心机；Hank’s平衡盐水；分离液；中和液。

　　步骤：①将组织块剪碎，以Hank’s平衡盐水洗去红细胞；②加分离液，37℃水浴，轻轻搅拌直到液体混浊；⑧在显微镜下检查细胞分离情况；④静置数分钟后轻轻倒出悬液，以双层纱布过滤，剩下的细胞团块可重新加分离液分离；⑤加入与细胞悬液等体积的中和液；⑥用滴管吹打10次，室温下静置5分钟后再放在冰上，⑦250g离心5分钟；弃上清，细胞重新悬于生理盐水中备用。

　　对于不同组织，酶用量和pH均可改变。除胰蛋白酶外，还可以用胶原酶、胰肽酶E、透明质酸酶或联合使用。

Ⅱ　化学法：

　　因为酶可以消化细胞膜上的某些成份，所以有人用非酶物质分离细胞。用TPB(tetraphenylborom)分离肝、脑、肾和结缔组织，但TPB能抑制细胞代谢。下面简单介绍Rappapont和Howze用TPB钠盐分离C3H小鼠肝脏细胞的过程。

　　器材和试剂：薄刀片；10ml移液管2只；玻璃滴管数只；带22号针头的注射器1个；磷酸缓冲液；蔗糖-盐溶液；TPB分离液。

　　步骤：①将肝组织切成3—5ml的薄片；②加10mlTPB分离液；③冰浴1—2小时，并用滴管上下吹打数次；④将细胞液通过一22号针头，形成单细胞，⑤250g离心5分钟，并以生理盐水洗2次去掉分离液。

　　被分离的肝细胞数目随TPB浓度的增加而增加，其最适浓度范围是每升10的负5次方至10的负2次方摩尔。

Ⅲ　机械法：

　　通常是将实体组织切碎，用带金属网或尼龙网的注射器制成单细胞。但此法易引起细胞破碎和丢失。Crissman(1976)的方法是：①将实体瘤切碎；②碎组织通过一500nm孔径的Teflon网；⑧细胞被收集于生理盐水液中；④此细胞悬液被通过一个100或60nm孔径的尼龙GM筛；⑤离心使细胞沉淀；⑥细胞沉淀直接悬液于染色液中。

5.固定方法

　　(1)福尔马林法：

　　在单细胞悬液中加入等体积含8％甲醛的盐水G，4℃下固定12至18小时。该法常用于Acriflavine-Feulgen染色。

　　(2)乙醇法：

　　细胞被重新悬浮于5ml冷盐水G中，慢慢加入-20℃95％的乙醇15ml，其最终浓度为70％，冰浴30分钟。此法常用于EB及PI染色。

　　(3)丙酮法：

　　细胞悬浮于冷生理盐水中，慢慢加入冷丙酮，使其最终浓度为85％。此法常用于病毒抗原的免疫荧光研究。

　　6.染色方法

　　在流式细胞光度术中最常用的荧光染料有20余种。其中包括抗生素类的光神霉素和色霉素、Feulgen形试剂Acriflavine和核酸插入剂EB及PI(Ethidium Bromide，Propidium Iodide)。

　　(1)Aeriflavine－Feulgen染色法：

　　器材和试剂：4mol/LHCl；普通离心机；Acrmavine－Feulgen染色液；盐酸—乙醇液。

　　步骤：①经福尔马林固定的细胞低速度离心后弃上清；②用蒸馏水冲洗1次，然后以4当量盐酸在室温水解20分钟；⑧离心后弃上清并以蒸馏水冲洗1次；④把细胞重新悬浮于Acriflavine—Feulgen染色液中，室温静置20分钟；⑤离心弃染色液，并用盐酸—乙醇液至少洗3次；⑥如做细胞体积测定或细胞分类可将样品悬浮于蒸馏水中，如进行细胞周期分析则悬浮于生理盐水中。

　　(2)EB及PI染色法：

　　器材和试剂：普通离心机；恒温水浴箱；RNA酶溶液。

　　步骤：①经乙醇固定的样品用RNA酶处理30分钟，37℃水浴；②离心后弃RNA酶，用冷蒸馏水洗1次；⑧在冰浴中用EB或PI染色液染色20分钟；④离心并弃染液，重新悬浮于蒸馏水或生理盐水中。

　　为缩短染色时间并提高染色特异性，Krishan介绍了一种将细胞直接悬浮于PI的低渗液中的染色法，这样可以破坏细胞膜直接染核染色质。用此方法得到的单细胞DNA组方图与用常规方法得到的结果基本相同。方法如下：细胞经150g离心5分钟；细胞直接悬浮于PI低渗液中，4℃5～10分钟；直接进行FCM分析。

　　(3)DNA－蛋白质双染色法：

　　对细胞进行多参数分析时，常对DNA－RNA或DNA－蛋白质进行双染色。测量后可获得一组细胞内蛋白质或RNA或DNA的含量，以及各种含量细胞数量之间的关系的三维组方图。下面以DNA/蛋白质(PI/FITC)染色为例(Crissman et al．1976)。 

　　器材和试剂：恒温水浴箱；普通离心机；RNA酶溶液；FITC染液；PI染液。

　　步骤： ①经70％乙醇固定的L1210白血病细胞；②在37℃，用RNA酶液处理30分钟；⑧离心后弃上清，并用蒸馏水洗1次；④先用FITC染液染30分钟；⑤离心后用蒸馏水洗1次；⑥再用PI染液染20分钟，冰浴；⑦蒸馏水洗1次并重新悬浮于生理盐水中，⑧进行FCM分析。

　　7.注意事项

　　(1)在样品制备过程中要尽量减少离心次数，以避免产生细胞团块和丢失细胞。

　　(2)要避免过长时间的固定并把细胞外的染料洗干净，以减少荧光本底。

　　(3)勿用下列固定剂：冰醋酸—乙醇，它能引起大量细胞丢失；苦味酸，因其本身发荧光并很难从细胞里去掉汞化合物，因其在细胞内形成结晶。

　　(4)在进行双染色时尽量选用激发光谱不接近的荧光染料。

　　(5)在进行细胞周期分析时，如CV值过大将导致非特异的胞浆染色。

　　8.附录－溶液配制

　　(1)PBS溶液：NaCl 1800mg、KCl 200mg、Na2HPO4 1150mg、KH2PO4 200mg、蒸馏水1000ml。

　　(2)胰蛋白酶溶液：NaEDTA液4ml(贮存液：1gNaEDTA溶于100ml蒸馏水)，每个包装胰蛋白酶(Difco)先加10mlPBS溶解，再加186mlPBS液，用前以0．2μm滤器过滤。

　　(3)Hank''s平衡盐水：NaCl、KCl 80g、40g、CaCl2 0.14g、MgCl2 0．10g、MgSO4 0．10g、Na2HPO4 0．06g、KH2PO4 0．06g、酚红0．006g、葡萄糖1．00g、NaHCO3 0．35g，以上各成份依次溶于1L蒸馏水中，10～15磅消毒20分钟，4℃冰箱保存。切勿摇动，以免出现碳酸钙沉淀。

　　(4)分离液：EDTA 0．5mmol/L，每毫升生理盐水-GM溶0．1mg胰蛋白酶。

　　(5)中和液：每毫升生理盐水中含0．2mg大豆胰蛋白酶抑制剂、DNA酶10．01mg、BSA 1mg。

　　(6)磷酸缓冲液：0．05mol/L蔗糖、0．14mol/L NaCl、0．002mol/L Na2HPO4。以NaHCO3调节pH。

　　(7)TPB分离液：TPB(K and K Laboratories Inc)为1％水液，冰冻保存，用前以蔗糖—盐溶液稀释。

　　(8)生理盐水-GM液：葡萄糖1．1g、NaCl 8g、KCl 0．4g、Na2HPO4·12H2O 0．39g、KH2PO40．15g依次溶于蒸馏水1000ml中。

　　(9)盐水G：MgSO4·7H2O 1．5g、CaCl2·2H2O 0．16g依次溶于1000ml生理盐水－GM中。

　　(10)Acriflavine—Feulgen染液：Acriflavine 0．2mg/ml偏重亚硫酸钾5mg/ml。

　　(11)盐酸—乙醇溶液：1ml浓盐酸加99ml 70％乙醇。

　　(12)RNA酶液：RNA酶10mg(Sigma)、Na2HPO4·7H2O 55．6mg、NaH2PO4 168．9mg，溶于10ml蒸馏水。

　　(13)PI低渗液：PI0．05mg/ml，0．1％枸橼酸钠水溶液。

　　(14)FITC染液：FITC 0．05mg/ml的0．5mol/L NaHCO3溶液。

　　(15)PI染液：0．1mg/ml的PBS溶液。

　　(16)色霉素—A3染液：CA3 1Omg、MgCl2·6H2O 1．5g在4℃溶于500ml蒸馏水(CA3不能在温水中溶解)。

　　(17)EB染液：1％的水溶液或1％的PBS液。

二.显微分光光度测定技术

1.概述

　　细胞显微分光光度术(microspectrophotometry)是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一个细胞内含量的一种实验技术，如DNA对紫外线最高吸收波长是260 nm。也可经过特异的染色反应，如DNA经Feulgen染色反应后就可以吸收波长为546nm的可见光波段，与分光光度仪测定溶液成分的方法相比，这种技术不仅可以定位，而且可以灵敏地测出一个细胞内某种成分的含量。

　　细胞显微分光光度测定法可分为紫外光显微分光光度测定法与可见光显微分光光度测定法。前者是利用细胞内某些物质对紫外光某波段特有的吸收曲线来测定相应物质的含量；后者则是根据某种物质特异的染色反应，然后再测定其对可见光某特定波段的吸收能力来进行对该物质的定量测定。