摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。

　　关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体

　　随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

　　纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

　　与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

　　重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

　　1 沉淀分离技术

　　1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。

　　1.2 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是：选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。

　　1.3 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电点时，分子表面净电为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，两性电解质的溶解度下降，从而沉淀析出。

　　1.4 变性沉淀法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀，而另一些组分保持不变，从而达到分离、除杂和提纯的目的。此方法包括：热变性沉淀分离；酸碱变性沉淀分离；利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离；利用酶进行变性分离。

　　2 液液萃取技术

　　液液萃取技术是常用分离技术之一，在生物化工中也有广泛的应用。然而，大部分生物物质是有生物活性的，需要在低温或室温条件下进行分离纯化，而采用传统萃取技术无法完成。

　　双水相萃取技术是近年来发展很快的一种生物分离方法，与传统的液液分离方法相比，双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：蛋白质在其中不易变性；分相时间短，一般只需5～15 min ；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等[3]。近年来一些学者将双水相萃取技术与膜分离技术结合起来，较好地解决了生物大分子在两相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。还有一些学者利用亲和反应的高度专一性，在萃取剂上接上一定的亲和配基，使得双水相萃取体系不仅具有处理量大的特点，而且具有专一性，提高了萃取效率。

　　液液反胶团(Reversed Micelles ,RM) 体系萃取技术是90 年代以来发展较快的另一种萃取技术, 是依赖表活剂液液萃取技术的一个分支 [4]。反胶团是离子型表面活性剂分散在非极性溶液中形成的,由表活剂的极性头向内形成一个围绕“水核”的纳米级微团[5]。在这微团中由于表活剂极性头的保护，可使包溶的的蛋白质不易变性。此外反胶团萃取体系还具有操作条件温和，对目标蛋白选择性好，容量大和易于扩大再生产的优点。当然反胶团体系萃取技术也有其不足之处，以往采用单一表活剂AOT 或季氨盐的反胶团萃取体系易受溶液pH、温度、离子强度和离子种类等因素的影响。目前为了克服这些缺点，往往在反胶团体系中加其它表活剂作助剂或者采用阴、阳和非离子复合型表活剂的反胶团体系的方法来解决[6]。

　　3 层析法

　　3.1 离子交换层析原理是用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电引力吸附在吸附剂上，同时从吸附剂上置换出另一种离子，然后用适当的溶液将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，从而达到分离的目的。其吸附作用来自离子间的静电作用。

　　蛋白质为两性物质，不同的pH，所带的电荷也不同。不同的pH和不同的离子强度下，蛋白质在不同的离子交换树脂上的吸附程度也不同。如果能够选择适当的条件，对蛋白质的分离纯化能起到事半功倍的效果。多数蛋白对酸碱不太稳定，因此对蛋白来说多用弱离子交换树脂。有一类特殊的商品化离子交换树脂，Sigma产品目录上成为聚缓冲液交换剂。先用某一pH缓冲液平衡聚缓冲液交换剂，再用另一pH缓冲液平衡，就能在这种离子交换剂上建立一个pH梯度。上样后，用一种具有pH梯度的聚缓冲液洗脱树脂时，被吸附样品中的蛋白质就能按照他们的等电点次序被依次洗脱。在这个过程中，同时产生聚焦作用，致使个蛋白质分级变得很窄，样品高度浓缩，整个分离过程也呈现出很高的分辨率，称为层析聚焦技术[7]。

　　3.2 疏水层析蛋白质内部有疏水部分，蛋白质表面常存在非极性氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸）形成疏水区、蛋白质的疏水程度取决于暴露的或埋藏的氨基酸的疏水性之和。疏水性氨基酸的数目、疏水性及他们的分布形成了蛋白质的特性。不同的蛋白质分子的疏水性强弱有较大差异。疏水层析就是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质分离纯化的方法。

　　在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水性相互作用增大。故蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度（离子强度）的提高而增大。因此，疏水层析中蛋白质的吸附需在高浓度盐溶液中进行，而洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。

　　由于疏水层析分析纯化蛋白质的原理与离子交换层析完全不同，因此疏水层析与离子交换层析互补短长，用于离子交换层析难以分离的蛋白。周维国等人以Octyl Sepharose 4 Fast Flow为层析介质分离硫酸铵分步沉淀法制备的重组蛋白MSH-Ang粗纯化样品，,回收率达85%,重组蛋白MSH-Ang纯度达65%以上[8]。

　　3.3 反相层析反相层析利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行蛋白质的分离纯化。与疏水层析相似，反相层析中溶质也是通过疏水性相互作用分配于固定相表面。但是反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或水溶液进行溶质的洗脱分离，多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。

　　反相层析主要用于相对分子量较小的蛋白质的分离纯化。其中运用最广泛的是反相液相色谱。Boyes等报道了用连续 RPLC 对细菌原液中的重组人淀粉状蛋白前体多肽片段进行分离[9]。

　　3.4 亲和层析许多生物活性物质具有与其他某些物质可逆结合的性质，生物物质的这种结合能力成为亲和力。生物亲和力具有高度的特异性，即一种生物物质只能与另一种特定的物质结合。亲和层析是将有亲和力吸附作用的物质分子（配基）偶联在固体介质（载体）上作为固定相，用以分离纯化目的蛋白的方法。

　　亲和层析具有高度的选择性、分辨率和载量优的特点，只需要一步处理便可从一个混杂有多种高浓度无关蛋白质的复杂材料中纯化出少量的目的蛋白，纯化系数可达数千倍，回收率很高，并且对纯化物有浓缩效果，是分离纯化蛋白质的有力工具。

　　根据配体与生物大分子之间相互作用体系的不同，可以把亲和层析分为以下四种类型。

　　3.4.1.生物亲和层析

　　利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。陈嫚用交联琼脂糖为载体,三聚氯氰为活化剂,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基,制备亲和填料，再用此亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体( reteplase，r-PA )，得到高纯度的r-PA[10]。林敏等将编码有一个血吸虫谷胱甘肽S转移酶(GST)基因的pGEX表达载体与重组基因进行融合表达,其表达产物易为GSTrapTM亲和层析柱中的GST单体特异性吸附,洗脱,浓缩后经5%NaHCO3特殊处理而获得高纯度的重组融合蛋白[11]。GST柱具有纯化条件温和、蛋白回收率高的优点,但它的非特异性吸附过高,如对纯度要求不高时,可作为较好的选择。

　　3.4.2.免疫亲和层析

　　利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。目前,利用抗体-抗原模式,有可能得到每一种目标蛋白的单抗,然后以单抗为配基,通过亲和层析技术分离纯化重组蛋白。此种方法的纯化倍数、活性回收率非常高。

　　FLAG融合标签是由八个氨基酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。利用FLAG融合标签可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。FLAG标签结构短小,且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点,可以通过肠激酶切割被除去。现已发展出了M1、M2和M5三种抗-FLAG单克隆抗体,FLAG融合抗原标签技术已经广泛用于重组蛋白质的纯化[12]。

　　陈登鸿就用单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素[13]。

　　3.4.3.固定化金属离子亲和层析

　　利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面裸露的供电子氨基酸残基,如组氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。洗脱时,通过改变pH，加竞争的螯合试剂等方法，依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。这是固定化金属离子亲和层析用于蛋白质分离纯化的根据。已发现金属离子如锌离子和铜离子能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。金属离子亲和层析具有分辨率高选择性好的特点，给分离蛋白质带来了很大方便。

　　冉波等利用镍离子亲和层析纯化获得带有六聚组氨酸尾的口蹄疫病毒VP1epi重组蛋白[14]。张怀等人以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以咪唑和pH洗脱方式对Hepcidin(铁调素)融合蛋白进行纯化,纯化后的融合蛋白纯度大于95 %,而且不含咪唑,有利于下一步铁调素的制备[15]。金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素的变性条件。这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利[16]。

　　在实际应用过程中金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质，而琼脂糖颗粒表面较为粗糙,容易产生一些非特异性吸附现象。这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中，而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况，90年代以来国外的一些科学家采用磁化或超顺磁化介质克服了这一缺点[17]。含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料，它们的颗粒非常细,表面极其光滑，将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。美国的Qiagen公司已将此技术利用到商品化。

　　近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来，在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。其基本原理是在目的基因的N端或C端加上6个His,这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。QIAexpress系统就是美国Qiagen公司提供的商品化的试剂盒。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分，可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离,有时可取得一步纯化的效果[18]。

　　3.4.4.拟生物亲和层析

　　拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。如染料亲和层析(DAFC)和氨基酸亲和层析(包括多肽亲和层析(AALA) [13]。染料配基，例如三嗪(Triazine)或三苯甲烷化合物，能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。

　　此外，国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度，主要有AKTA系统、扩张柱床吸附层析、径向膜层析、灌注层析、置换层析等。

　　置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果,依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下,形成一系列已分离的置换序列[14]。

　　置换层析与传统洗脱层析的比较见下表：

　　表1置换层析与传统洗脱层析的比较

	置换层析	传统洗脱层析
分离机理	被吸附组分之间对固定,相亲和性大小不同	吸附的平衡常数不同导致各组分在流动相中有不同的速度
洗脱峰形	矩形的平台洗脱峰形	钟罩形洗脱峰形
上样量	饱和吸附量的40%~60%	饱和吸附量的5%
样品洗脱后浓度	浓缩状态分离	稀释状态分离
有无拖尾	无	有
分辨率	极高	高

　　置换层析常常用于分离其他层析技术无法去除的分子量大小和带电荷数均与目的蛋白极为相似的杂蛋白，甚至可以去除目的蛋白的折叠异构物。置换层析的另一大优点是在高分辨率的情况下依然保持很高的上样量,这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段。

　　4 重组蛋白包涵体的分离纯化

　　4.1 包涵体的形成包涵体形成的原因：(1)高水平表达时，疏水作用和离子作用以及蛋白质自身的错误折叠导致表达蛋白在宿主细胞胞质中形成包涵体；(2)宿主细胞内的还原性环境使表达蛋白二硫键稳定性下降，出现错配二硫键；(3)宿主细胞蛋白酶对异源蛋白的降解作用；(4)原核细胞内缺乏真核生物蛋白质的加工与修饰系统；蛋白质形成的动力学研究表明：蛋白质折叠是一个产热过程，多种蛋白质在体内折叠过程中均有不耐热的中间体形成，这些中间体在宿主细胞温度升高时成为包涵体的前体物质，随后聚合成包涵体[21]。

　　4.2 包涵体对分离纯化的影响

　　在原核表达系统中表达的重组蛋白多以无活性的包涵体形式存在，需复性为活性蛋白分子才能加以应用。实践证明，包涵体对蛋白质的分离纯化有几方面的影响：(1)可以很容易的与胞内可溶性蛋白杂志分离，使得分离纯化较容易完成。包涵体具有高密度，对机械搅拌和超声破碎不敏感，并且在水溶液中通常不溶，因此可以通过简单的离心就可以分离得到，并且可以较容易的与胞内可溶性的杂质蛋白分离，有利于表达蛋白的分离纯化；(2)包涵体可以从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂(如尿素、盐酸胍、SDS)溶解，在适当条件下(pH、离子强度与稀释)复性，产物经过一个变形的过程，较易形成错误折叠和聚合体；(3)包涵体的形成虽然增加了提取的步骤，但包涵体中目的蛋白的纯度较高，可达20%~80%，且重组蛋白以包涵体的形式表达能有效地抵御如大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解；(4)对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是最佳的选择。

 　　4.3 包涵体蛋白的分离纯化

　　4.3.1.包涵体的分离纯化

　　用机械或超声等方法粉碎细菌，离心后取沉淀。由于包涵体相对稳定。可在去垢剂溶液或低浓度变性剂(如尿素)中初步洗涤纯化，而进一步纯化目前多用凝胶电泳(如SDS-PAGE、微过滤电泳等)、超滤／透析及各种色谱方法分离，常用的色谱方法有固定金属离子亲和色谱(如Ni—NTA亲合色谱)、Sepharose离子交换色谱、反相高教液相色谱(HPLC)、分子筛(SephadexoG-10)凝胶柱层析等。

　　具体选用何种工艺需要根据不同的重组蛋白而定，但在选择方法时基本要遵从以下原则：(1)选择能够最有效利用不同性质进行分离的方法；(2)尽可能用高得率的步骤；(3)把比较费事的和能有效提高纯度的步骤放到最后去做。 

　　4.3.2.包涵体蛋白的溶解与还原

　　为了将包涵体中非天然折叠的多肽链打开，用高浓度的尿素和盐酸胍结合还原剂还原并溶解但涵体蛋白，但高浓度的尿素和盐酸胍会便蛋白质完全变性，不利于随后的复性。 Tris缓冲液、TritonX一100，强阴离子及阳离子表面活性剂(N一十六烷基吡啶氧化物、十六烷基三甲基氯化铵等)等溶剂则能使包涵体蛋白保持部分活性，从而提高重组蛋白的复性率。

　　4.3.3.包涵体蛋白的复性

　　蛋白质复性过程同时受到动力学及热力学因素的影响。形成天然活性蛋白质要求形成正确的二硫键及相互作用的结构域单元。所以，常在复性液中加入还原／氧化的巯基促进正确二硫键的形成。

　　复性前通常用稀释、透析、凝胶过滤层析等方法除去变性剂以促进复性，低浓度变性剂有助于提高活性蛋白最终产量，故复性液中常需加入一定浓度的变性剂 J。复性时加入低分子量添加剂(如L-精氨酸、去垢剂、Ca2+ 等)抑制蛋白聚集或利用基质结合技术也可提高复性率。

　　一般的复性方法是在低浓度蛋白质的条件下，用空气氧化或还原／氧化谷胱甘肽氧化法促进变性蛋白质复性，复性率低。使用含有还原剂的阳离子表面活性剂(N-十六烷基吡啶氧化物)可一步溶解及复性包涵体蛋白，不需进一步的快速稀释或透析即能提高复性率。用碱性溶液溶解包涵体并用强阴离子交换剂固定蛋白，则可在相当高的浓度一步进行蛋白的纯化与复性，克服了复性必需在低蛋白浓度的限制。反相微团是表面活性剂在有机溶剂中形成的纳米水平(1～10nm)的水相液滴，能在接近中性、低盐浓度的条件下纯化、抽提蛋白质，反相微团的水相池中溶解的蛋白质可保持部分活性，是一种快速、可连续操作、有潜力的液提取技术，适用于重组蛋白的大批量生产

　　综上所述，一般首先是菌体破碎，放出包涵体，包涵体经多次不同溶液洗涤后，溶解，然后利用柱层析纯化。纯化后蛋白用复性剂恢复蛋白活性。大致程序如此，其间可能由于不同蛋白或工艺需要，采用不同方法纯化，但基本以此程序为准[22]。

 　　4.4 复性蛋白质的检测蛋白质的复性必须要有相应的检测方法，以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物理性质及蛋白变性态与天然态的区别，检测的方法可以帮助优化复性方法和复性条件。最常见的方法有以下几种[23]： 

　　(1) 凝胶电泳 其中最常用的是还原和非还原的SDS-PAGE，适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态。 

　　(2) 色谱学方法 主要利用蛋白质的色谱保留行为来研究已复性蛋白质、折叠中间体、聚集体与天然状态的蛋白质的构象差异。最常用的色谱方法是凝胶排阻色谱(SEC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC). 

　　(3) 光谱学方法 主要有紫外色谱、荧光色谱和圆二色谱CD等，这些方法可用来研究蛋白质复性过程中构象的变化，特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象。

 　　(4) 黏度与浊度 蛋白质的折叠状态不同，其溶解度存在一定差异，从而影响其黏度的变化，因此可以通过测定溶液的浊度来反映蛋白质聚集的快慢与程度，通常检测600nm或400nm处的吸光度。

　　(5) 免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异，来测定不同状态蛋白质的构象变化。

 　　(6) 生物学活性及比活性的测定 这是一个对最后的折叠状态进行评价的重要指标，一般通过动物或细胞模型直接测定复性蛋白所具有的生物学效应来表示。

 　　4.5 重组Prohibitin融合蛋白包涵体的纯化

　　Prohibitin是近年来新发现的一种分子量为29．8kD、与肿瘤有关的蛋白。由异丙基一β—D硫代半乳糖苷(IPTC)诱导重组大肠杆菌BL2l(pET30a(+)-prohibitin)表达，其融合蛋白包涵体经过离心、超声破碎、洗涤、变性、复性后，用Ni—NTA Agarose亲和层析柱分离纯化 通过12％ SDS—PAGE胶和Bradford法检测其纯度和目的蛋白含量，用ELISA对纯化后的蛋白进行鉴定，纯度达90％以上。含量约0.3mg／ml[24]。

　　蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来,而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。综观重组蛋白质分离纯化技术的新进展,我们可以看到这样一个发展趋势:今后重组蛋白的分离纯化的技术发展将围绕着快速,高分辨率,高上样量,易于操作,低成本和电脑控制的全自动化等技术而展开。希望今后科学工作者能找出更多更好的方法来提纯蛋白质。