1 前言

　　RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。它从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明——这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。

2 综述

2.1 研究历史与发展前景

2.1.1 定义

　　双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference, RNAi ）双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。

2.1.2 研究历史

　　RNAi现象早在1993年就有报道： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。

2.1.3 作用机理

　　目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。

　　双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。

　　另一方面结合的产物以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

　　siRNA还能够通过某种不太明了的机制永久地关闭或者删除DNA片断，以在非常大的程度上控制染色质的形成，而不是仅仅暂时地抑制它们的活动。

　　动植物和人体的病原体中有一些是RNA病毒，如导致艾滋病的HIV和SARS的冠状病毒都是RNA病毒。有些RNA病毒在复制过程的一定阶段中会产生双链RNA。如果宿主体内有分解这种双链RNA的酶，就可将双链RNA降解。

反义RNA技术改良

　　用反义RNA分子来调节基因表达时，经常会遇到的困难是反应模板的稳定性差。因此，人们正在探索如何改进反义基因的新方法，目前主要有：

　　（1）优化反义RNA的结合。反义RNA链的长度对抑制基因的效果是重要的。双螺旋形成过程中将释放能量，RNA链越长，释放的自由能越多。从这一意义来讲，可以说长RNA作为反义RNA更有效。但是，并没有关于反义RNA长度的一般规则。Nellen和Lichtentein曾指出，有关反义RNA技术的一个普遍问题是，怎样使反义RNA更有效，即怎么样使一个互补的RNA成为有效的反义RNA。在植物中覆盖整个cDNA的反义RNA有效地抑制了基因表达。但是，与5¹或3¹端部分mRNA互补的反义RNA效果同样好。最小的反义RNA只有41个核苷酸。

　　反义RNA的二级结构对双螺旋的形成至关重要。因为形成双链结构必须克服正义和反义RNA本身的二级结构，比潜在自由能的绝对量更重要的是形成双螺旋的作用能量，也就是说，双螺旋构象是由动力学控制的，而不是由释放的自由能的绝对量控制的。原核生物中自然发生的RNA可以很好的说明RNA结构与形成双螺旋构象的速度之间的复杂关系。Simons和Kleckner指出，许多非常有效的反义RNA通常较短（约70个核苷酸），含有一个典型的茎环结构。例如大肠杆菌R1质粒的拷贝数受反义 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者详细研究了这一系统，其正义和反义RNA由同一DNA编码，但以相反方向转录。因此，点突变一点也不能改变这两种RNA的互补性，但是当同时改变正义和反义RNA环区时，虽然两条RNA链完全互补，但结合率下降了三至四倍。与此同时，质粒拷贝数却增加了。很显然，结合率受正义和反义RNA二级结构的影响。两条RNA链形成双螺旋的初始“吻合”结构非常重要。

　　毫无疑问，内源的正义RNA不能被改变，但反义RNA的靶结合区及反义RNA的长度是可以改变的。这将影响反义RNA的二级结构，从而改变其结合能力，使其与靶RNA结合更有效。Rittner等令人信服地证明了反义RNA的长度与它的结合率之间的复杂关系。他们用一个5¹端长度固定的人免疫缺陷型I型病毒（HIV-I）的反义RNA，改变其3¹端，从而改变了RNA长度。然后选择能够快速结合的反义RNA，发现结合率长度之间的关系依长度和相应二级结构的不同而摆动。3¹端只有几个核苷酸不同的反义RNA结合率变化可达上百倍。这与反义RNA的二级结构的改变有关。而且，体外的结合率与体内抑制HIV-I增值的有效性一致。这些结果也证明了在体内应用反义RNA抑制靶基因之前，在离体条件下实验的重要性。

　　在优化反义RNA的实际长度以前，也可以用计算机辅助分析靶RNA，以寻找有效的靶RNA序列，通过设置一个50~400核苷酸的窗口，Sczakiel等设计了基因组和非基因组HIV RNA的能量。这些能量反映了区域折叠能力。观察到高△G值（低自由能）区域与抑制HIV复制的最有效区相对应。

　　（2）延长反义RNA的半衰期。原核生物中自然发生的反义RNA极其稳定，可能是由于它们特殊的茎环结构保护它们免受核酸外切酶的降解。据报道，通过控制插入序列IS10的RNA-OUT，能在体内稳定存在70 min，达三代之久。在反义RNA的末端加上这些保护性的茎环结构，可以减少核酸外切酶的降解。Heinrich等应用了这一方法。最近，Bourque和Folk报道，一个变相方法是把反义RNA与tRNA连接，用一个依赖于DNA的RNA聚合酶III特异启动子来表达。

　　（3）在细胞质中表达反义RNA。另一个能够获得高水平表达的反义RNA的方法是在一个游离的复制系统中表达反义基因。这种系统不同于转基因于细胞核内染色体上。已有几个应用植物RNA病毒作为载体的系统，在细胞质中表达反义RNA。Joshi等用萤火虫萤光素酶基因代替了大麦条斑病毒（BSMV）RNA β的开放读码框b，并且在转染烟草和玉米原生质体时表达；Donson等用一个以TMV为基础的载体来产生细菌新霉素磷酸转移酶（NPT II）。Chapman等应用马铃薯病毒X（PVX）为载体，表达了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）。Dolja等把GUS插入到烟草蚀刻病毒（TEV）的多聚蛋白中，得到了表达。因此，在这样的系统中表达反义RNA是完全可行的。刘博林等借助于Chapman等的PVX载体表达系统，在野生烟草（N. clevelandii）细胞质中成功表达了对应于plum pox virus（PPV）的反义RNA和酶性RNA。这为在细胞质中抑制RNA病毒的复制研究奠定了良好的基础。

RNA制备的技术问题

1、RNase 是RNA制备的杀手

　　RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的另一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。

2、塑料制品、玻璃和金属物品的处理

　　(a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下：

　　(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

　　(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

　　(3)在通风柜中室温处理过夜。

　　(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

　　(5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。

　　(b)玻璃和金属物品

　　250°C烘烤3小时以上。

3、什么时候需要分离mRNA?

　　答：常规RT-PCR鉴定基因表达水平的，一般都可以采用总RNA作为RT-PCR 的模板，但是做cDNA文库，克隆丰度极低的基因，大多数DD-PCR， 削减杂交等需要纯化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dT)，从组织或总RNA种直接分离mRNA。

4、如何判定分离的总RNA的纯度？

　　答：需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。变性电泳需要采用MOPS系统，不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低（<1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。

5、什么时候需要加入RNA-Carrier?

　　答：样品很少或样品中RNA含量低，制备RNA时需要加入一定的 RNA载体，以提高RNA纯化的得率。常用的载体有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen。一定浓度范围的 Carrier对一些RNA的下游应用没有影响，如RT-PCR, Northern Blot。

6、如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA?

　　答：无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的。如果您希望得到DNA free 的RNA样品，需要用RNase free的DNase I处理。

7、纯化的RNA样品如何保存？

　　答：如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。

8、组织和细胞样品如何收集，保存？

　　答：组织样品收集后，需要立即保存在液氮中，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用。一般实验收集50-100mg组织就足够了。

9、如何估计RNA的产量？

　　答：能计算出RNA的产量，通常都是有比较多的起材料，但是很多情况下能够取得材料很少，所制备得到的RNA无法通过分光光度的方法测定含量和浓度。RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关，例如用抽提小鼠组织100mg 肝可以得到500ug总RNA, 100mg肺 得到200ug总RNA，1百万个细胞Hela细胞可以得到15ug左右的总RNA. mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%。根据这样一些经验值，估算出您可能得到的量。样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。

10、RNA制备过程中那个环节要特别注意？

　　答：一般情况下，细胞和组织在RNA抽提液中都可以保存一段时间，因为几乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂，RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也没有多达关系。但是通常是离心后取上清，这时候RNA已没有保护，操作要特别小心。

　　引物长度的选择、纯化方式及选择与合成过程

　　引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。

　　长链引物出错几率非常高的原因是：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

　　引物常用的纯化方式脱盐、BioRP / OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

◆　脱盐

　　寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-氰乙氧基――磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。

◆　BioRP / OPC纯化

　　如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，则N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性，有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团，所以，我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。

◆　HPLC

　　如果合成的寡核苷酸应用于克隆，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

　　对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。

 

　　目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE 公司生产，而Bioneer自行研制的专利384并行高通量DNA合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

　　亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

　　第一步，将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

　　第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

　　第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

　　第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

　　经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

　　通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。