蛋白印迹操作流程
2012-05-031934
蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，简称WB，是用免疫学方法检测蛋白，研究蛋白质的表达调控的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)可以选用适当的裂解液，如赛驰生产的WIP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用我公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳，电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(10X)。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准 。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求，也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
在Western实验中，我们推荐选用PVDF膜，也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商推荐的使用步骤。
转膜时，通常可使用赛驰提供的多功能电泳仪。转膜电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的蛋白印迹转膜电泳缓冲液(10X)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为300-400mA，转膜时间为30-60分钟或15-20mA于4℃转膜过夜。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的WB洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。为减少液体使用量，避免干膜，您可以选用赛驰生物提供的杂交袋进行后续操作，可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)可以选用适当的裂解液，如赛驰生产的WIP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用我公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
(3) 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳，电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(10X)。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准 。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求，也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
在Western实验中，我们推荐选用PVDF膜，也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商推荐的使用步骤。
转膜时，通常可使用赛驰提供的多功能电泳仪。转膜电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制，也可以使用赛驰生产的蛋白印迹转膜电泳缓冲液(10X)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为300-400mA，转膜时间为30-60分钟或15-20mA于4℃转膜过夜。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的WB洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。为减少液体使用量，避免干膜，您可以选用赛驰生物提供的杂交袋进行后续操作，可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
