一、MicroRNA原理介绍
MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。
MicroRNA形式
1. pre-miRNA
约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。
三. MicroRNA选择
★pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免（当合成RNA超过60bp时，出现一个碱基错误率约30％），转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。质粒载体形式的pre－miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。
★人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。
★原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。
★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。
★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti－virus时，病毒的质量批间差异较大。
★AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti－virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。
四. MicroRNA产品
| 产品 | 制备方式 | 大小 | |
| Pri-microRNA | 天然Pri-microRNA库 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 |
300－1000 bp | |
| 人工Pri-microRNA库/订制 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 |
约500 bp | ||
| Pre-microRNA | 合成 化学合成或生物转录 |
约70bp | |
| 载体 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 |
|||
1. pri－miRNA库
★所有的pri-miRNA都是从人类基因组DNA中扩增出来的，其长度大约为300bp－1000bp。
★microRNA完全忠实于细胞内的天然结构,具有更高的效率。
★microRNA表达质粒载体，可以直接使用。microRNA转录结构单元已经构建到基于FIV的慢病毒载体，同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容，方便制备病毒。
★EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。
★microRNA质粒经过严格测序。
★部分制备的microRNA质粒或病毒经过生物学测定，microRNA效果肯定与明确。
★已经完成microRNA列表(部分)，请Email咨询查找其它的miRNA。
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miRNA名称 |
测序结果 |
miRNA大小 |
载体 |
生物学测定 |
|
1 |
hsa-mir-98 |
ok |
562 |
B |
Ok |
|
2 |
hsa-mir-96 |
ok |
511 |
B |
Ok |
|
3 |
hsa-mir-95 |
ok |
495 |
B |
Ok |
|
4 |
hsa-mir-17-92 |
ok |
978 |
L |
Ok |
|
…… |
…… |
…… |
…… |
…… |
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|
513 |
hsa-mir-18a |
序列错误 |
681 |
L |
Ok |
|
514 |
hsa-mir-345 |
一个突变 |
548 |
L |
Ok |
|
515 |
hsa-mir-589 |
Ok |
620 |
L |
Ok |
|
516 |
hsa-mir-219-2 |
Ok |
610 |
L |
|
|
517 |
hsa-mir-215 |
ok |
458 |
L |
Ok |
|
518 |
hsa-mir-212 |
一个突变 |
474 |
L |
Ok |
|
...继续中 |
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B：同时有质粒、慢病毒质粒载体和腺病毒质粒载体；
L：仅有慢病毒载体。可根据要求改构到您希望的载体。
更多及详细microRNA情报请通过Email：tech@bluegene.cc咨询。
更多新发现的microRNA请参见MiRBase：http://microrna.sanger.ac.uk/
2. pri－miRNA或pre－miRNA载体/载体构建服务
★BG有256个构建好的pre－miRNA。
★pre-microRNA表达质粒构建
①microRNA转录结构单元通过增强型Pol III 启动子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引导pre-miRNA的过表达。
②可选择带EGFP荧光标签。
③终产品均经过严格测序。
④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
★pri－microRNA表达质粒
①pre-microRNA＋mir155的microRNA两臂共同组成pri-microRNA。
质粒可用于直接制备基于FIV的慢病毒，并同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容。
②EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。
③终产品均经过严格测序。
④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
3. 生物转录合成microRNA
产品形式为70bp左右的pre-microRNA。
生物合成的microRNA有较之化学合成的microRNA有更高的稳定性及效率。以晶赛专利的高保真RNA生物合成技术为基础的microRNA产品有着迄今最好的正确率，从而确保您实验的成功。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
4. 化学合成的microRNA
产品形式为70bp左右的pre-microRNA。
化学合成非常快捷，您定购一周后就可以开始您的实验。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。
5. MicroRNA病毒载体
腺病毒MicroRNA
全部MicroRNA产品均能够以腺病毒形式提供。
慢病毒MicroRNA
提供慢病毒MicroRNA质粒、转染试剂、包装细胞，操作方法。您可以方便地自己制备慢病毒。
五. 服务价格
天然pri－microRNA：2900元/50 ug microRNA，包括质粒对照。
Pre－microRNA载体构建：1900元/50 ug microRNA，包括质粒对照。
其它形式的microRNA，请咨询。
