| DNA甲基化分析 | DNA提取 | Northern blotting | PCR 技术服务 |
| RealTime PCR | RNA 提取 | RNA干扰 | RT-PCR |
DNA甲基化分析
一、实验原理
甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.
二、实验步骤
三、样品准备
细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
一、实验原理
甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.
二、实验步骤
三、样品准备
细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
DNA提取
一、实验原理
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，因此DNA的提取也是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作之一。我公司提供从各种不同来源的样品（如细菌、真菌、血液、培养细胞、动物组织及植物组织等）中提取高纯度基因组DNA的服务。
二、实验步骤
1、细胞裂解
● CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可融解细胞膜，并与核酸形成符合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7M NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。此法多用于植物组织、真菌等材料。
● SDS法 SDS是一种阴离子去污剂，高温（55℃-65℃）下可裂解细胞，使蛋白变性、染色体解析。常用于血液、细菌、酵母、动物组织、细胞等样品基因组DNA的提取。
● 其他方法 物理方法如机械剪切、超声波破碎、匀浆等，化学方法如异硫氰酸胍、碱裂解、蛋白酶K消化等。
2、DNA分离纯化
● 用酚/氯仿抽提裂解液，收集水相，乙醇沉淀DNA，最后用TE溶解DNA沉淀。
3、DNA的定量及检测 ● 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的分子质量。
● 紫外分光光度计检测DNA浓度 DNA在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。
提取的基因组DNA样品浓度＝OD260×50ug/ml×稀释倍数
● 紫外分光光度计检测DNA纯度
一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度。OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若小于1.7有可能有蛋白污染；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经降解。
三、样品处理
因细胞结构及所含成分不同，样品预处理的方法也有差异。不同样品的预处理方法大致如下：
● 植物组织——液氮研磨
● 动物组织——匀浆、液氮研磨
● 培养细胞——蛋白酶K消化
● 细 菌——溶菌酶消化
● 酵 母——Lyticase消化、玻璃珠破碎 注意：客户最好提供新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻溶。
一、实验原理
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，因此DNA的提取也是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作之一。我公司提供从各种不同来源的样品（如细菌、真菌、血液、培养细胞、动物组织及植物组织等）中提取高纯度基因组DNA的服务。
二、实验步骤
1、细胞裂解
● CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可融解细胞膜，并与核酸形成符合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7M NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。此法多用于植物组织、真菌等材料。
● SDS法 SDS是一种阴离子去污剂，高温（55℃-65℃）下可裂解细胞，使蛋白变性、染色体解析。常用于血液、细菌、酵母、动物组织、细胞等样品基因组DNA的提取。
● 其他方法 物理方法如机械剪切、超声波破碎、匀浆等，化学方法如异硫氰酸胍、碱裂解、蛋白酶K消化等。
2、DNA分离纯化
● 用酚/氯仿抽提裂解液，收集水相，乙醇沉淀DNA，最后用TE溶解DNA沉淀。
3、DNA的定量及检测 ● 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的分子质量。
● 紫外分光光度计检测DNA浓度 DNA在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。
提取的基因组DNA样品浓度＝OD260×50ug/ml×稀释倍数
● 紫外分光光度计检测DNA纯度
一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度。OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若小于1.7有可能有蛋白污染；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经降解。
三、样品处理
因细胞结构及所含成分不同，样品预处理的方法也有差异。不同样品的预处理方法大致如下：
● 植物组织——液氮研磨
● 动物组织——匀浆、液氮研磨
● 培养细胞——蛋白酶K消化
● 细 菌——溶菌酶消化
● 酵 母——Lyticase消化、玻璃珠破碎 注意：客户最好提供新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻溶。
Northern blotting技术服务
一、Northern blotting技术原理
Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
二、实验流程
1、RNA混合物进行琼制糖凝胶电泳
2、分离得到的RNA转膜
3、与放射性标记的探针杂交
4、结果分析
三、样本准备
提取好的核酸
一、Northern blotting技术原理
Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
二、实验流程
1、RNA混合物进行琼制糖凝胶电泳
2、分离得到的RNA转膜
3、与放射性标记的探针杂交
4、结果分析
三、样本准备
提取好的核酸
PCR技术服务
一、实验原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
二、实验步骤
PCR扩增
根据客户的实验目的，进行PCR反应的优化。
1、变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2、退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3、延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
三、样品准备
1、模板制备
客户提供PCR所需模板（质粒、基因组DNA、PCR产物等），或者提供样品，我们制备模板。
2、引物设计
客户提供上、下游引物，或者提供目的基因的相关信息（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等），我公司提供免费的引物设计及合成。
一、实验原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
二、实验步骤
PCR扩增
根据客户的实验目的，进行PCR反应的优化。
1、变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2、退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3、延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
三、样品准备
1、模板制备
客户提供PCR所需模板（质粒、基因组DNA、PCR产物等），或者提供样品，我们制备模板。
2、引物设计
客户提供上、下游引物，或者提供目的基因的相关信息（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等），我公司提供免费的引物设计及合成。
RealTime PCR技术服务
一、荧光定量PCR化学原理介绍
实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
二、主要实验步骤
1、设计并合成Realtime PCR引物。
2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR® Green）的PCR反应的优化。
3、 样品RNA抽提 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4、RNA质量检测
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度
b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5、使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
6、 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7、标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测。
8、 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9、提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。
三、样本准备
组织或细胞标本
一、荧光定量PCR化学原理介绍
实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
二、主要实验步骤
1、设计并合成Realtime PCR引物。
2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR® Green）的PCR反应的优化。
3、 样品RNA抽提 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4、RNA质量检测
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度
b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5、使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
6、 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7、标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测。
8、 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9、提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。
三、样本准备
组织或细胞标本
RNA 提取技术服务
一、RNA提取原理
核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA )是由核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成的多聚体。不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如参与蛋白质生物合成的RNA有信使RNA、转移RNA和核糖体RNA;与转录后加工有关的RNA有核小RNA、核仁小RNA;与生物调控有关的RNA有微RNA、干扰小RNA等。TRIzol或RNAzol等试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相、快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其他成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA，此方法主要用于总RNA的提取。
二、RNA提取服务流程
1、试剂耗材无RNA酶处理;
2、材料的收集：包括组织、细胞、血液等;
3、样品的处理;
4、RNA的提取;
5、RNA的纯化;
6、RNA的电泳检测;
7、RNA的纯度和浓度的测定。
三、材料要求
1、尽量选用新鲜的材料;
2、实验材料涉及危险品，Bluegene公司不予服务;
3、提供尽量详细的实验背景材料，如种属;
4、样本足量，组织一般大于100mg;
5、低温保存，低温运输。
一、RNA提取原理
核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA )是由核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成的多聚体。不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如参与蛋白质生物合成的RNA有信使RNA、转移RNA和核糖体RNA;与转录后加工有关的RNA有核小RNA、核仁小RNA;与生物调控有关的RNA有微RNA、干扰小RNA等。TRIzol或RNAzol等试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相、快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其他成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA，此方法主要用于总RNA的提取。
二、RNA提取服务流程
1、试剂耗材无RNA酶处理;
2、材料的收集：包括组织、细胞、血液等;
3、样品的处理;
4、RNA的提取;
5、RNA的纯化;
6、RNA的电泳检测;
7、RNA的纯度和浓度的测定。
三、材料要求
1、尽量选用新鲜的材料;
2、实验材料涉及危险品，Bluegene公司不予服务;
3、提供尽量详细的实验背景材料，如种属;
4、样本足量，组织一般大于100mg;
5、低温保存，低温运输。
RNA干扰技术
一、原理：
siRNA质粒载体构建技术服务， RNAi( RNA interference, RNA干扰技术)，即将与内源 mRNA 编码区同源的小片段（19 －23bp）外源双链 RNA（double s`tranded RNA ）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应 mRNA 的降解，从而导致特定基因表达沉默的一种技术。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。
二、流程：
1、siRNA表达载体的选用：
本公司选用的siRNA 表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp抗性基因，可以无限扩增。
2、设计siRNA靶序列：
A 、根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19 － 21nt 长。
B 、对于每条选定的siRNA 靶序列，设计 siRNA 正义链和反义链，以 loop9nt 相连，称为 shRNA（short hairpin RNA）。
C、阴性对照的设立.
3、合成模板：
合成每条编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，退火 DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamHI 和 HindIII 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamHI 和 HindIII 酶切位点之间。
4、siRNA 空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1 ％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。
5、连接与转化：
把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为 3 ： 1 。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37 ℃培养过夜。
6、PCR 鉴定
7、测序鉴定
8、柱抽提阳性克隆载体并定量。
三、样本要求：
您只需提供需干扰基因的详细信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所属物种，本公司负责设计3条针对目的mRNA的siRNA 靶序列，在短时间内构建三个可用于目的mRNA干扰实验的siRNA 载体。可以为您节省大量的时间与精力。此方法是多种siRNA制备方法中唯一可以进行长期基因沉默研究的方法。
一、原理：
siRNA质粒载体构建技术服务， RNAi( RNA interference, RNA干扰技术)，即将与内源 mRNA 编码区同源的小片段（19 －23bp）外源双链 RNA（double s`tranded RNA ）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应 mRNA 的降解，从而导致特定基因表达沉默的一种技术。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。
二、流程：
1、siRNA表达载体的选用：
本公司选用的siRNA 表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp抗性基因，可以无限扩增。
2、设计siRNA靶序列：
A 、根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19 － 21nt 长。
B 、对于每条选定的siRNA 靶序列，设计 siRNA 正义链和反义链，以 loop9nt 相连，称为 shRNA（short hairpin RNA）。
C、阴性对照的设立.
3、合成模板：
合成每条编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，退火 DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamHI 和 HindIII 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamHI 和 HindIII 酶切位点之间。
4、siRNA 空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1 ％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。
5、连接与转化：
把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为 3 ： 1 。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37 ℃培养过夜。
6、PCR 鉴定
7、测序鉴定
8、柱抽提阳性克隆载体并定量。
三、样本要求：
您只需提供需干扰基因的详细信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所属物种，本公司负责设计3条针对目的mRNA的siRNA 靶序列，在短时间内构建三个可用于目的mRNA干扰实验的siRNA 载体。可以为您节省大量的时间与精力。此方法是多种siRNA制备方法中唯一可以进行长期基因沉默研究的方法。
RT-PCR技术服务
一、RT-PCR技术原理
反转录PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法，可满足客户不同的实验要求。
二、操作流程
● 模板制备：见RNA提取技术服务。
● 引物设计
客户提供上、下游引物，或者我公司提供免费的引物设计及合成（包括RT-PCR半定量检测中的内参引物）。
● 反转录
（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。
（2）70℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
（3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
42℃保温1小时。
（5）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。
若需要表达，参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析，接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。
三、样本准备
提供的样品要新鲜并尽可能多，不推荐提供RNA样品，或者提供cDNA，并尽可能详细的提供背景资料（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等）。
一、RT-PCR技术原理
反转录PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法，可满足客户不同的实验要求。
二、操作流程
● 模板制备：见RNA提取技术服务。
● 引物设计
客户提供上、下游引物，或者我公司提供免费的引物设计及合成（包括RT-PCR半定量检测中的内参引物）。
● 反转录
（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。
| 试剂名称 | 使用量 |
| 模板RNA | 2μg |
| Oligo(dT)12-18Primer（50μM） | 2.5μl |
（3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
| 试剂名称 | 使用量 |
| 上述模板RNA/引物变性溶液 | |
| 5×M-MLV Buffer | 5μl |
| dNTP Mixture（各10 mM） | 1.25μl |
| RNase Inhibitor（40 U/μl ） | 25U |
| M-MLV（200 U/μl ） | 200U |
| RNase free dH2O | up to 25μl |
（5）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。
若需要表达，参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析，接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。
三、样本准备
提供的样品要新鲜并尽可能多，不推荐提供RNA样品，或者提供cDNA，并尽可能详细的提供背景资料（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等）。