Datasheet
一、实验原理
本试剂盒根据不同细胞器在沉降系数方面的差异，通过系列离心，搭配试剂盒内特定缓冲溶液获取高度纯化、结构完整的线粒体。
实验采用较温和的方法破碎细胞，将线粒体释放出来。随后用较低的离心力离心去除大部分细胞器，上清用较高的离心力离心沉淀线粒体。得到粗提物的主要成分为线粒体，内质网等其它细胞器杂质。随后将其均匀铺设在高密度、低粘度、等渗、无毒特定介质上，离心获取目标产物线粒体。
实验示意图：
二、试剂盒内容
一、结构
线粒体是真核细胞内的双层膜细胞器，一般呈短棒状或圆球状，直径在0.5到10微米左右（因生物种类和生理状态而异）。线粒体由外至内可划分为外膜、膜间隙、内膜和基质四个功能区。外膜比较光滑，内膜则向内褶皱形成线粒体嵴。嵴形状是判断线粒体的重要形态学指标。
一、样本收集
1、收集细胞：
对于贴壁细胞：吸弃培养基，PBS洗一遍，用胰酶消化细胞，37℃ 5分钟。1000rpm室温离心5分钟，收集细胞。
二、操作步骤
1、准备溶液：
根据实验需要，取适量试剂A，按比例加入试剂D（100×），混匀即可，配置成AD混合液。
2、预处理：按每2000万个细胞，加入0.3-0.5ml预冷的AD混合液，轻轻悬浮细胞，放置于冰上5分钟。（注：小体积研磨破碎效率高于大体积）
3、研磨：
破碎细胞过程如下：使用研磨器研磨大约30-45次，并进行匀浆效果鉴定实验（不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同）。
通常建议研磨途中取10ul细胞匀浆液，加入10ul台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性（蓝色）细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%，即可增加10次匀浆，随后进行相同的检测操作。当阳性比例超过50%时即可进行下一步，切勿过度研磨，否则会导致线粒体的损伤。
4、用AD混合液冲洗研磨器壁，连同研磨后的匀浆液转移至5ml 离心管中，4℃，1000g离心10分钟，将获得的上清转移至另一离心管中，4℃，10000g离心10分钟，沉淀即为粗提线粒体。
5、向粗提线粒体中加入1ml 试剂E5，轻轻吹打使线粒体悬浮。
在超速离心管中由下向上按如下顺序添加不连续密度梯度介质：0.5ml 试剂E1，1ml 试剂E2，1ml 试剂E3，1ml 试剂E4，1ml含有线粒体的试剂E5。铺层完毕，4℃，52000g 离心90分钟。
6、离心完毕，小心用枪吸取位于E3和E4分层的物质（具体情况可能需要根据实验结果调整），将溶液收集到普通EP管中，加入三倍体积的试剂A混匀后，4℃，10000g离心10分钟，收集沉淀。
7、将沉淀用试剂C洗涤一次，4℃，10000g离心10分钟，沉淀即为纯化后结构完整的线粒体。
8、线粒体的处理：
客户可以根据自己的实验需要将纯化后的线粒体产品进行以下处理
A：加入100-250ul试剂C重悬线粒体，得到线粒体悬液，进行线粒体活性相关的检测。
B：向线粒体沉淀中加入200-500ul 试剂B（含试剂D），冰上裂解0.5小时。最后4℃，12000g离心10分钟，上清即为线粒体蛋白样品。
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