一、背景
     来源历史：昆虫细胞表达系统，是近年来创新药的表达宿主之一。虽然小众，但是在部分药物的成本和功能上，也有其特定的优势。常见的有Sf9，Sf21和High five等。

     High Five cell，是一种来源于于粉纹夜蛾昆虫的卵巢细胞的细胞。于1992年美国植物研究所（Boyce Thompson Institute，BTI）发现的粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni，Tn)来源，克隆号为5B1-4，故而命名编号为BTI-Tn-5B1-4，Tn-5B1-4或High 5，Hi-5，Tn-5等[1]。和Sf9一样，都是可以通过杆状病毒感染/转染，并来表达重组蛋白药物的昆虫细胞系。但是相比Sf9细胞，Hi-5细胞系表达的重组蛋白量更高。且比较特殊的是，Hi-5细胞也被常用于生产大量的小分子核糖核酸、小分子干扰核糖核酸及piRNA药物[2-5]。在我们培养过程中，观察到该细胞是呈淋巴母细胞样的半悬浮生长，且略微松散存在。Hi-5细胞系的原代细胞分离方法，见下图1。

图1

 

     最初，High 5的分离方式是，取粉纹夜蛾昆虫的卵，70%乙醇消毒和无菌水清洗后，放入培养皿中，分离卵中的胚胎卵巢，然后剪碎成组织碎片，培养24-48小时，来得到High five细胞[6]，细胞状态可见为松散、悬浮、半贴壁，多显示为圆形，见图2A。High five感染eGFP杆状病毒48 hpt，激光共聚焦显示，对细胞核染色(Blue, Hoechst), 细胞膜染色(Red, CellMask™)，胞内eGFP为绿色，见图2B。细胞状态与Manon M. J. Cox报道一致。

图2

     在使用High five细胞进行重组药物表达时，通常使用两种方式，即无病毒瞬时基因表达 (Virus-Free Transient Gene Expression) 和杆状病毒表达载体系统 (BEVS)。前者主要使用PEI脂质体转染，后者用来做杆状病毒是同源重组法 (HR-bac，载体基因类型为BAC10:KO1629, Δv-cath/chiA)感染。工具载体包括pAC8 set，pAC8_MF set，pOPIN set质粒组合。杆状病毒感染Sf9细胞后的效果，如图3。可见感染杆状病毒后，有红色荧光marker表达，见图3A。且western-blotting有显著条带，见图3B。

图3

 

二、昆虫细胞表达系统的突出特点

     虽然E.coli和CHO HCP表达系统仍然为大分子蛋白蛋白药物的主流，但是无论从翻译后糖基化修饰，成本，产量和基因改造便利程度方面，都有着E.coli和CHO HCP无法比拟的优势，我们统计了昆虫细胞表达的优势与未来趋势[7]，见下表1。

表1

     同时，昆虫细胞常用的转染/感染方式，在不同的应用场景也有各自的优缺点[8]，特点列举[8,9]，见表2。科研/制药者，可以根据场景进行选择。所以昆虫细胞生产的Cervarix和Flublok之类的疫苗药物，和Provenge的治疗性疫苗药物，也凭借性能优势，业已上市[10,11]，见表3。

表2

表3

     最常见的昆虫细胞，有High five，Sf9和Sf21细胞。Sf9和Sf21来源于草地贪夜蛾蛹种属，形态为圆形，基因组与转录组信息也已明确。但是表达能力均低于来源于粉纹夜蛾的High five细胞。且其糖基化相关基因与Sf21更为接近[12-16]，其更详细细胞系特征差别，见表4，5。

表4

表5

三、昆虫细胞 HCP产品开发

     基于上述昆虫细胞表达特征和蛋白药物的应用潜力，由于该表达系统使用较少，且不如CHO细胞研究深入，所以市场上该类HCP较少，尤其是High five HCP ELISA试剂盒产品为中国唯一，全球唯二的存在。

     赛唐生物开发了High five HCP(货号：HF-H0026-3D1)和Sf9 HCP(货号：SF-H0025-3B1)体系产品。为生物医药市场的昆虫细胞表达体系的应用，提供了有力的帮助。并已进一步优化应用，和HCP特征性分析。

     High five HCP ELISA为HRP标记的二抗，形成的双抗体夹心法试剂盒。标曲范围控制在0-800ng/mL，本底控制Blank＜0.15，DL&QL分别为3.128ng/mL & 12.5ng/mL，CV≤10%，且在多种缓冲体系下，有着良好的回收效果（70%-130%）。且4℃稳定性≥1年。经过验证HCP特异性，发现High five HCP与293/E.coli 3s HCP交叉反应＜2%，与/E.coli 6s/X-33/GS115/酿酒酵母HCP无明显交叉反应。数据见图4，表6-8。

Note：原始数据来源，分别为N251713-052，N251713-049和N251713-049。

图4

表6

表7

表8

 

四、展望

     赛唐生物，专注与聚焦HCP研究与产品开发15年，至此已完成12类，共计24种HCP体系化产品上市。并配套对应技术服务，如，ELISA试剂盒优化与调试，覆盖度分析等。并已协助多款药物进入临床期和上市。

     去除疫情期增长泡沫影响，扎根质量控制。紧跟NMPA监管目标，并跟随中国药企发展阶段来适度更新检测技术。适应中国国情，避免盲目改动，因为避免规格的急速改变，避免增加药企的成本牺牲和负担。始终坚持以解决实际问题导向，和药企客户踏实走好每一步。坚持做小，做精。

 

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参考文献
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[2] Davis TR, et al. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.. Bio/technology (Nature Publishing Company). 1992. 10 (10): 1148-50.

[3] Wickham, TJ; Nemerow, GR. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.. Biotechnology progress. NaN, 9 (1): 25-30 [2019].

[4] Granados RR, et al. A New Insect Cell Line from Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4) Susceptible to Trichoplusia ni Single Enveloped Nuclear Polyhedrosis. Virus. J. Invertebr. Pathol. 1994, 64: 260-266.

[5] Fu, Yu, et al. The genome of the Hi5 germ cell line from Trichoplusia ni, an agricultural pest and novel model for small RNA biology. eLife. 2018

[6] J.M. VLAK. Insect cell cultures: fundamental and applied aspects.

[7] Janin Korn et al. Baculovirus-free insect cell expression system for high yield antibody and antigen production. Scientific Reports.10: 21393. 2020.

[8] Grose C, Putman Z, Esposito D. A review of alternative promoters for optimal recombinant protein expression in baculovirus-infected insect cells. Protein Expr Purif. 2021. 186:105924.

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[14] 2015, Methods in Enzymology. Lukasz Skora et al. Insect Cell Culture.

[15] Sf21.2014, Animal Biotechnology. Anju Verma

[16] Enoch Y. Park et al. Comparative Characterization of Growth and Recombinant Protein Production among Three Insect Cell Lines with Four Kinds of Serum Free Media. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2003. 8(2):142-146.

 

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