研究背景
当前生物制药管线，针对炎症、癌症和感染性病的治疗的主要药物形式是单抗药物。主要抗体药物靶点有TNFα，VEGF/VEGFR，PD-1/PD-L1，HER2，IL12/IL23，IL17/IL17R等等。2019年市场规约1400亿美元，而且逐年递增。
抗体药物由最初的鼠源抗体，到人鼠嵌合抗体，再到人源化和全人源化抗体发展，并衍生了Fab抗体、单域和单链等抗体形式。如今单抗也衍生出了创新型抗体药物如小分子抗体，抗体偶联药物，抗体融合蛋白，双特异性和多特异性抗体[1]。
常见的蛋白药物表达系统，有原核表达系统，如Escherichia coli ，E.coli；植物表达系统；真菌表达系统，如毕赤酵母，酿酒酵母；昆虫表达系统，如Spodoptera frugiperda cells，SF9昆虫细胞；哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)，非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney cells，Vero）等。其中哺乳动物细胞表达系统，在临床药物的生产中，使用较为广泛。后续我们介绍了常见蛋白表达系统及其品系特点，蛋白纯化所用填料介质及其应用范围，以及蛋白纯化过程中需要重点关注的杂质残留，及其致病性或降低蛋白活性和稳定性的成分（含杂质残留检测方法的研究进展）。
以CHO为例，CHO细胞产生的HCP，种类多样，复杂[2]。仓鼠与人类有80%共同基因，CHO HCP和人内源蛋白有同源性，残留的HCP也会导致自身免疫反应，并引起与人自身蛋白的交叉反应[3,4]。
法规要求
在抗体药物表达后，随即进行培养上清收集等下游纯化操作。而下游操作的设计主要是宿主细胞总蛋白（Host cell protein, HCP）、核酸（质粒，宿主基因组，RNA），脂质，和产品相关杂质[5]。最终产品的HCP水平<100ppm，残留DNA<10ng/剂，和<5%的高分子量的免疫总量[6]。
宿主细胞总蛋白介绍
宿主细胞总蛋白：对HCP的分析中，根据产物中HCP的作用，可以将之分为4类[121]：
1）具有高生物活性的蛋白。其中的杂质，如CHO-K1分泌的转化生长因子β1对多类型细胞，都有很强的多重效应，并对人体细胞有诱导免疫的活性[7]。
2）对产物蛋白或产物保护剂有分解作用的酶类。在大分子配方中，改善蛋白在生产，运输和储存中的稳定性[8]。如吐温80受到磷脂酶切割分子脂键，分解成脂肪酸和醇，导致药物保护活力丧失。
3）对宿主有较强免疫原性的蛋白，具备佐剂效应，并会诱导炎症和免疫反应。诱导释放的细胞因子，并导致抗原呈递过程相关的细胞表面标志物的上调。
4）对机体或产物蛋白无作用，但是和产物蛋白能够共结合并纯化下来的一类蛋白。
HCP检测的经典方法介绍
经典的HCP检测方法有双向电泳，蛋白质谱和酶联免疫吸附试验。且FDA规定，该三种方法要相互验证，以期能获得准确的检测结果。
同时也有创新的方法引入，如液相色谱串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)和Immunoassay platform ELLA和Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA)等方法。
目前，ELISA实验依赖于其优异的特异性，灵敏度和高通量，仍是HCP检测的金标准。同时结合LC-MS与2D方法结合验证。
赛唐生物基于ELISA方法，专注HCP产品领域研发10年，踏实做技术开发与制造。可以提供以下全流程专属性技术服务。
免疫与抗体制备
动物免疫是蛋白抗原，借助包裹抗原溶液的免疫佐剂，将抗原递送到皮下，经过T help细胞将抗原呈递给B细胞，并形成浆细胞，分泌特异性抗体到血液中。将HCP蛋白抗原与佐剂充分混合，皮下免疫年轻雌性兔，五次免疫，各间隔两周后，酶联免疫吸附法检测血清效价，做加强免疫或动脉采血宰杀收集血清抗体。免疫后抗体效价可以达到106-107水平。抗血清量可达数十至数百毫升。
纯化与抗体标记
动脉采血，4℃ 过夜后，离心取上清，即为抗血清。经过盐析，Protein A/G亲和层析，非IgG类蛋白流穿，IgG通过Fc端结合到Protein A结构域上，过量的结合缓冲液，平衡后低pH洗脱，有尖锐UV洗脱峰。收集洗脱液，并平衡至中性pH。 经过缓冲液置换，浓缩，Nanodrop One C UV以及Bradford法定量，并标记生物素或者辣根过氧化物酶，用于HCP的结合验证实验。
试剂盒QC
标准曲线
LOD/LOQ
回收率
稳定性
加速破坏实验显示，试剂盒4℃可储存一年。保质期可6个月。
样本检测
使用药物产物样本，和细胞上清样本，显示药物产物基本优于进口品牌，细胞培养上清优于进口品牌。(注：鉴于细胞培养上清是赛唐生物提供，可以做第三方进一步对比。)
参考文献：
[1] Chadd HE, Chamow SM. Therapeutic antibody expression technology[J]. Current Opinion In Biotechnology, 2001, 12(2): 188-194.
[2] Smales C M, Dinnis D M, Stansfield S M, et al. Comparative proteomic analysis of GS-NS0 murine myeloma cell lines with varying recombinant monoclonal antibody production rate[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 88(4):474-488.
[3] Gutiérrez AH, Moise L, De Groot AS. Of [hamsters] and men: A new perspective on host cell proteins[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2012, 8(9):1172-1174
[4] Kanade Shinkai, Markus Mohrs & Richard M. Locksley. Helper T cells regulate type-2 innate immunity in vivo[J]. Nature, 2002, 420:825-829.
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赛唐生物是由海归科学家与业内资深教授专家为首并组建的一支稳定且拥有关键的核心技术的科研队伍，拥有蛋白库/cDNA库产品制备和验证、重组蛋白生产制备和鉴定技术、体外诊断检测试剂等多个研发平台，为生命科学和生物制药的药物设计、药物筛选、药物生产以及药物质量验证提供全方位的服务。致力于成为独立商业运作的拥有自主知识产权以及核心技术、核心产品、核心技术服务的-全球专业的蛋白研究中心。坚持以专业的技术、专业的服务、专业的产品为理念服务于客户，为生命健康领域持续输出具有核心竞争力的产品和服务为目标，从而为人类健康贡献力量。
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